生物制品的无菌检查法的实验原理、准备工作及操作步骤是什么？

作者：何歌珧时间：2023-07-23 12:42:39

导读：" 生物制品是指由活体组织、细胞或其分离物制备而成的制品，如细胞培养物、疫苗、血液制品等。在生物制品的生产和使用过程中，无菌检查是非常重要的环节，以确保产品的质量和安全性。无菌检查法主要是通过将待检样品接种到含有丰富营养物质的培养基中，并通过培养一定时间后观察"

　　生物制品是指由活体组织、细胞或其分离物制备而成的制品，如细胞培养物、疫苗、血液制品等。

　　在生物制品的生产和使用过程中，无菌检查是非常重要的环节，以确保产品的质量和安全性。

　　无菌检查法主要是通过将待检样品接种到含有丰富营养物质的培养基中，并通过培养一定时间后观察是否有微生物的生长来判断样品是否为无菌。

下面将介绍无菌检查法的实验原理、准备工作及操作步骤：

实验原理：

　　1.无菌检查法是基于微生物在适宜的营养环境下生长和繁殖的原理。

　　2.待检样品中如果存在微生物，则在培养基中会形成可见的菌落。

　　3.通过观察培养基上的菌落形态、大小、颜色等特征，以及进行进一步的鉴定，可以确定微生物的种类和数量。

准备工作：

　　1.需要准备无菌的培养基和培养器具，如琼脂培养基、试管、移液管等。

　　2.准备待检样品，并将其进行适当的稀释，以便于观察和计数。

操作步骤：

　　1.确保操作台面和手部已经进行消毒。

　　2.取一定量的琼脂培养基，将其加热溶解后，倒入含有微量的试管中。

　　3.将待检样品取一定量，加入到试管中，充分混匀。

　　4.将试管放入培养箱中，设置适当的温度和湿度条件进行培养。

　　5.根据不同的微生物种类和培养时间，在培养基上观察是否有菌落形成。

　　6.进行菌落的计数和鉴定，确定样品是否为无菌。

　　通过以上无菌检查法的实验原理、准备工作及操作步骤，可以对生物制品进行无菌检查，确保产品的质量和安全性。同时，在实验过程中需要注意操作的无菌条件，避免污染和误判。

生物制品的无菌检查法的实验原理,准备工作及操作步骤?

文献资料-医学书籍-中国生物制品规程

生物制品无菌试验规程

　　　　生物制品不得含有杂菌（有专门规定者除外），灭活菌苗、疫苗不得含有活的本菌、本毒。

　　在制造过程中应由制造部门按各制品制造及检定规程规定进行无菌试验，分装后的制品须经质量检定部门做最后检定。

　　各种生物制品的无菌试验除有专门规定者外，均应按照本规程的规定进行。

　　1　抽样

　　1.1原液及半成品

　　　　原液及半成品应每瓶分别进行无菌试验，其抽样量应至隐型少为0.1%，但不得少于1.0ml。

　　　　1.1.1　大罐稀释的制品抽样数量不得少于10ml。

　　　　1.1.2　原液及半成品每开瓶一次，应如上法抽验。

　　1.2　成品

　　　　每亚批均应进行无菌试验，样品应随机抽取，应具有代表性（包括分装过程的前、中、后样品）。

　　　　1.2.1分装量在100支（瓶）或以下者抽检不少于5支，101～500支（瓶）者抽检不少于10支（瓶），501～10000支（瓶）者抽检不少于20支（瓶，10001支（瓶）以上者抽检40支（瓶）。

　　　　1.2.2每瓶装量20ml以上的冻干血液制品，每柜冻干200瓶以下者抽检2瓶，200瓶及以上者抽检4瓶。

　　6～20ml抽检量加倍。

　　5ml和5ml以下者按1.2.1项抽检。

　　　　1.3凡规定需作支原体检查的制品，均应在半成品时按亚批进行检查，成品可不再做。

　　2　无菌试验用培养基（培养基处方可附录1）

　　　　2.1　检查制品中本菌是否存活应采用适于本菌发育生长的培养基（在半成品时检查，有专门规定者除外）。

　　　　2.2　检查需氧性和厌氧性杂菌应采用硫乙醇酸盐培养基。检查不含汞类防腐剂制品中的需氧性和厌氧性杂菌时，该培养基中可不加硫乙醇酸盐。

　　　　检查霉菌和腐生菌应采用改良马丁培养基。

　　　　检查混浊制品可采用不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基。检查活菌苗时可加大琼脂含量，做成斜面。

　　　　2.3　检查支原体应采用猪胃消化液半固体或牛心消化液半固体培养基。

　　　　2.4　生物制品无菌试验用培养基亦可用经检定合格的干燥培养基配制。

　　　　2.5　无菌试验培养基的灵敏度，乙型溶血性链球菌（32210株）应达到10-8，短芽胞杆菌（7316株）和生孢子梭状芽胞杆菌（64941株）应达到10-7，白色念珠菌（ATCc10231）和腊叶芽枝霉应达到10-6。

　　　　2.6　生物制品无菌试验培养基由质量检定部门与培养基制造部门会同进行灵敏度试验。每当更换主要原材料时，应进行灵敏度试验，合格后方可应用（灵敏度试验法见附录2、3）。

　　　　2.7　各生产单位的质量检定部门应定期抽检无菌试验培养基的灵敏度，检定所应定期抽检各所的无菌试验培养基。

　　3　无菌试验方法

　　　　3.1　无菌试验取样、移种等全部操作，应在无菌操作室内或无菌条件下进行，无菌操作室应经常保持清洁，在每次操作前，应彻底消毒。

　　　　3.2　菌苗、疫苗、类毒橡携禅素、抗毒素类制品及粘稠不易过滤的血液制品应用直接接种法进行无菌试验。人白蛋白及人丙种球蛋白（包括各种剂型及应用途径的制品）应用薄膜过滤法进行无菌试验，其他血液制品亦可用薄膜过滤法或直接接种法进行。

　　3.3　直接接种法

　　3.3.1　菌苗、疫苗、类毒素、抗毒素类制品

　　　　3.3.1.1　每安瓿装量5.0ml以上者（不含5.0ml）取样不应少于1.0ml，装量在5.0ml以下者（含5.0ml）取样不得少于0.5ml，装量不足0.5ml者，全部吸取。

　　　　3.3.1.2　含防腐剂的制品，接种量与培养基的比例：用苯酚或氯仿作防腐剂者至少为1:20，用汞作防腐剂者或制品内含有甲醛、抗生素者至少为1:50。

　　先按此比例接种于硫乙醇酸盐培养基内增菌，于20～25℃培育3～4天后移种至硫乙醇酸盐培养基、适宜的琼脂斜面、改良马丁培养基各2管，每管0.5ml。

　　将硫乙醇酸盐培养基、适宜的琼脂斜面各1管置30～35℃培育，其余各管置20～25℃培育，培育时间除有专门规定者外共为8天。

　　　　3.3.1.3　不含防腐剂制品，装量在5.0ml以下者（包括5.0ml）每10支安瓿混合，装量在5.0ml以上者每7支安瓿混合，将混合后的样品直接接种一组梁尘培养基，分别置20～25℃、30～35℃培育，培育时间共为8天。

作者：天使也美丽2006-2-2416:39　回复此发言

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2生物制品无菌试验规程

　　　　3.3.1.4　支原体培养基临用时将半固体煮沸10～15分钟后，冷却到56℃左右，加入未灭能马血清或灭能小牛血清和酵母浸液（培养基、血清、酵母浸液之比为7:2:1），并可酌情加入适量青霉素或醋酸铊，充分摇匀，等冷至35～37℃时种入待检样品0.5～1.0ml，共接种2支培养基，置35～37℃培育14天。

　　　　3.3.1.5混浊和接种后不能判定结果的制品，可取规定量的样品接种于不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基（200ml）内进行增菌培养，3～4天后移种。培养基种类和支数、培育温度同3.3.1.2项，共培育8天后判定结果。

　　3.3.2　血液制品

　　　　3.3.2.1　取规定抽样数，按下列规定，从每瓶抽取样品，并全部接种完。

　　　　样品每瓶装量不足1.0ml者，抽取全量，1～20ml以下者（不含20ml），抽取1.0ml以上，每支装量为15ml的培养基，接种1.0ml。

　　　　样品每瓶装量以下者（不含）抽取5.0ml以上,100ml及以上者按15%抽样，每支装量为40ml的培养基，接种5.0ml。

　　　　应接种的培养基支数依取样的总量而定。接种硫乙醇酸盐培养基与改良马丁培养基支数之比为2:1。

　　　　接种后将硫乙醇酸盐培养基总支数的1/2置30～35℃培育，其余置20～25℃培育，改良马丁培养基置20～25℃培育，培育时间不少于14天。

　　3.4　薄膜过滤法

　　　　滤膜孔径为0.22～0.3μm。

　　　　取规定抽检样品数，每瓶装量100ml及100ml以下者取全量，100ml以上者取半量加入灭菌薄膜过滤器内，加压或减压过滤。

　　如为含汞防腐剂者，在样品过滤后，应用灭菌生理盐水或其他适宜溶剂冲洗滤膜3次，每次100ml。

　　过滤后，无菌取出滤膜，分别放入硫乙醇酸盐培养基2支及改良马丁培养基1支（每支装量不少于40ml，高度不得低于7cm）。

　　如果使用一个过滤装置，则将该膜剪成三等分，分别放入规定培养基中。

　　将滤膜放入培养基后，一支硫乙醇酸盐培养基置30～35℃培育，其余各支培养基置20～25℃培育。

　　培育时间不少于7天。

　　　　最好采用全封闭式一次性微孔过滤集菌器，要求每支培养器培养装量为100ml。

　　　　3.5　检查厌氧性杂菌用培养基需加热驱氧者，必须冷却到45℃以下再行接种。

　　　　3.6　冻干制品按使用说明书或瓶签规定的稀释量稀释后进行无菌试验。

　　4　判定

　　　　4.1　无杂菌生长判为合格（有专门规定者除外）。

　　　　4.2　无菌试验发现杂菌生长，可复试。

　　该制品量应加倍。

　　若复试仍有同样杂菌生长，该制品判为不合格。

　　如为不同杂菌生长，可第二次复试，复试样品为第一次复试量的2倍，若仍有杂菌生长该制品判为不合格。

　　支原体阳性者不复试，该批制品判为不合格。

　　　　4.3　成品无菌试验不合格的亚批数占整批的30%以上时，由质量检定部门会同有关部门根据具体情况，全部或部分废弃。

　　附录1无菌试验培养基处方

1硫乙醇酸盐培养基

胰酪蛋白胨（或酪素胰酶消化液，以总氮计2000mg）15g

酵母浸出粉（或酵母透析液200ml）5g

葡萄糖

氯化钠

2.5g

L-胱氨酸（或半胱氨酸盐酸盐）

0.5g

硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸0.6ml）

0.5g

琼脂

0.65～0.75g

新鲜配制的0.1%刃天青溶液（或0.2%美蓝溶液0.5ml）

1.0ml

去离子水（或蒸馏水）

加至1000ml

最后pH7.1±0.2

2　硫乙醇酸盐培养基（不含琼脂）

胰酪蛋白胨（或酪素胰酶消化液，以总氮计2000mg）

15g

酵母浸出粉（或酵母透析液200ml）

葡萄糖

氯化钠

2.5g

L-胱氨酸（或半胱氨酸盐酸盐）

0.5g

硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸0.6ml）

0.5g

去离子水（或蒸馏水）

加至1000ml

最后pH7.1±0.2

3改良马丁培养基

葡萄糖

20g

蛋白胨

酵母浸出粉（或酵母透析液100ml）2g

磷酸氢二钾

硫酸镁（含7分子结晶水）

0.5g

去离子水（或蒸馏水）

无菌检验方法验证

　　无菌检查方法是为了检查药典要求无菌的制剂及其他制品是否无菌而建立的试验方法！至于无菌检查具体有哪些验证方法呢？下面就随我一起来了解下吧！

　　无菌检验方法验证

　　　　无菌检查方法验证一般分为前验证和再验证两种。

　　　　前验证，也称预验证，指在无菌分析方法正式使用前，按照预定验证方案进行的验证。如果没有充分的理由，任何检查方法必须进行前验证。

　　　　再验证，指某一检查咐戚前方法经过验证并在使用一段时间后进行的，旨在证实已验证状态没有发生飘移而进行的重新验证及对检查方法进行修订、改变时进行的验证。

　　　　通常一个无菌产品的检查流程为：首先基于产品的剂型、溶解度等性质，按照药典的要求确定是否需要进行前处理;然后根据产品的特性是否有抑菌性，确定是否需要增加去除产品抑菌性的方法;最后验证整个检查方法中用到的一切及试验过程中的每一个环节包括样品的预处理方式、检查过程、培养条件等均不影响样品中微生物的生长。

　　　　前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应是验证的重点。

　　　　供试品中抑菌活性的去除是当前验证工作的重点，尤其强调应充仔迹分验证供试品本身对微生物生长的影响。

　　(一)具体的验证方法如下：

　　1.菌种的选择

　　　　无菌检查方法验证中通常选择以下6种试验中常用的控制菌的标准菌株，它们分别代表不同类型的菌种：枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]代表药品中常见的污染菌——芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]代表革兰阳性菌、生孢梭菌[CMCC(B)64941]代表厌氧菌、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]代表革兰阴性菌、白色念珠菌[CMCC(F)98001]代表酵母菌、黑曲霉菌[CMCC(F)98003]代表霉菌。

　　2.菌液的制备

　　　　接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30~35℃培养18~24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，23~28℃培养24~48h，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。

　　接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23~28℃培养5~7天，加入3~5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。

　　然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。

　　3.样品的前处理

　　　　无菌产品中每个成分应该是均匀的，因此只要确定在验证的方法中，按所需的总接种量即可，而不必像样品日常检测中按规定的容器数取样。

　　　　如果制备样品时需要使用溶解剂、稀释剂、助溶剂、破乳剂等溶剂，需要确保这些溶剂是有效的，并且其使用对微生物生长无影响;或者制备过程中需要对样品进行加热助溶、离心等操作时，需要确保加热的温度、离心速度和离衡清心时间等对微生物生长或分布无影响。不需前处理的样品免做。

　　(二)消除样品抑菌性的方法

　　　　无抑菌性样品的验证方法：依据产品溶解性和微生物限度选择合适的中性稀释剂溶解和稀释，用直接接种法验证，常用中性稀释液或淋洗液。

　　　　对于具有抑菌性样品的验证方法，首先确定样品的抑菌作用(抑细菌、真菌试验验证)，选择敏感标准菌株对供试品抑菌活性去除效果检查(阳性菌回收试验)。常用的消除样品抑菌活性的方法如下：

　　　　1.稀释法：利用降低供试品的相对浓度，将样品稀释至最低抑菌浓度下进行。如：取规定量的样品溶液至较大量的培养基中，使单位体积内的样品含量减少，至不含抑菌作用。

　　　　2.薄膜过滤法：利用体积差异分离，通过薄膜过滤，微生物被截于滤膜，培养薄膜观察有无微生物生长。

　　通常薄膜孔径应不大于0.45μm，直径一般为50?mm，若采用其他直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。

　　滤器和滤膜在使用前采用适宜的方法进行灭菌。

　　使用时应保证滤膜在过滤前后的完整性。

　　水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。

　　油类供试液其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。

　　供试液经过滤膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100?ml。

　　总冲洗量不得超过1000ml。

　　　　3.化学中和法：利用化学(生物)专属性灭活，常用中和剂或灭活方法有：对氨基苯甲酸、卵磷脂、聚山梨酯-80等。对化学中和剂不敏感的样品，用酶中和，如β-内酰胺酶。

　　　　4.联合使用：将以上两种或几种方法组合运用，以消除样品的抑菌性。适用于抑菌作用较强的中西药制剂。

　　5.其次按照以下要求制备3组样品：

　　　　样品组：选择以上适当的方法中和样品，加入少量验证微生物(接种量少于100cfu)。

　　　　对照组：0.1%蛋白胨或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液,加少量微生物(接种量少于100cfu)。

　　　　阳性对照组：将试验菌株直接接种于培养基中(接种量少于100cfu)。

　　6.最后结果分析如下：

　　　　样品组与对照组微生物生长数量相似，表明中和剂的中和方式有效消除了样品的抑菌性(即有效性)，如果对照组与阳性对照组的微生物数量相似，表明样品预处理、消除样品抑菌性的方法、检测程序和培养条件等均不影响微生物生长(即无毒性)。

　　样品如无抑菌性，省去对照组试验，样品组与阳性对照组直接比较。

　　样品组微生物生长数量不及阳性对照组微生物生长数量，表明样品的预处理、试验用器具材料、培养条件等方面存在对微生物生长不利的因素。

　　　　(三)为考查验证方法的稳定性和重现性，验证至少需3个不同批次的同类样品，分别进行3次验证试验。

　　无菌检查方法验证试验设计

　　　　薄膜过滤法：按照药典的要求取每种培养基规定接种的样品总量按薄膜过滤法过滤、冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，过滤。

　　取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养或改良马丁培养基中，或将培养基加至滤桶内。

　　另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。

　　按照药典的要求的温度和时间进行培养。

　　　　直接接种法：取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管;取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入小于100?cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培养基规定的供试品接种量，另1管作为对照，按照药典的要求的温度和时间进行培养。

　　结果判断

　　　　同对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明验证通过;如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，验证失败，应采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂和灭活剂、更换滤膜等方法，消除供试品的抑菌作用，重新进行验证。

　　无菌检查的常见方法

　　　　首先要检查方法验证方案设计的科学性和完整性，是否有与药典方法相悖的地方，尤其是产品本身的抑菌性，检查方法的选择，是直接接种法还是薄膜过滤法等。

　　　　无菌检查方法验证的硬件是否具备及是否已经进行了相关的确认。如使用黑曲霉菌是否具有生物安全柜并进行确认，无菌室的确认及日常监测，培养箱的型号及数量和进行确认的情况等，智能集菌器、全封闭无菌试验过滤培养器的型号、性能，滤膜是否符合规定等。

　　　　验证中各个环节有关数据的真实性，如产品本身抑菌性试验数据，菌种回收率和培养基适用性和灵敏度检查数据，菌种的传代、销毁和使用记录，无菌检查操作记录、培养记录等。

　　　　无菌检查中偏差的处理是否真的找到了根本原因，是否在没有确切的原因前就对样品重新检查并依据新的检查结果放行产品。

　　　　验证的方法与无菌检查操作规程和无菌检查记录是否完全一致，如操作步骤、检查方法、检查环境、试验耗材均需与实际检查操作规程及验证过程完全相符。

　　　　为了考查验证方法的稳定性和重现性，验证时是否至少采用了3个不同批次的同类样品，分别进行了3次验证试验。

　　　　使用新的滤膜或过滤器(不同厂家或批号、型号)是否重新进行样品试验组、蛋白胨对照组和阳性对照组的验证确认。

　　　　除非样品不能采用过滤的方法(难溶解)，企业是否采用全封闭的薄膜过滤法。

　　　　菌液的保存条件和保存期限是否符合药典的要求，对于黑曲霉孢子悬液是否有验证的资料。

　　无菌检查的注意事项

　　　　培养基的适用性检查包括培养基的无菌性检查和培养基的灵敏度检查。

　　　　中国药典附录中规定的检验数量不包括阳性对照用样品量，虽然附录另处有专门说明，仍然容易忽略。

　　　　无菌检查时应强调“检验数量”，主要是保证试验结果的代表性，而阳性对照试验和验证时仅须满足“检验量”总量要求即可，以保证试验结果的可靠性，验证试验可以由此减少大量的样品;工作菌株的传代次数不得超过5代，以防止过度的传代增加菌种变异的风险。这里“代”的定义是指，活的培养物接种到微生物生长的新鲜培养基中培养，任何亚培养的形式均被认为是转种或传代一次。

　　　　菌液加入，按规定应在最后一次冲洗液中加入阳性菌液，主要是考虑过滤器的有效性。过滤器的有效性应由提供企业控制，用户可采用适当方法抽查(如检查阳性菌液通过滤筒的流出液)。

　　　　实验室菌种的处理和保存的程序应标准化，以尽可能减少菌种污染和变异。

　　　　试验时菌悬液并不是只要活的菌体就行，而是要保持旺盛的生命力，所以菌悬液存放时间不能太长。

　　　　菌液制备后若在室温下放置，应在2?h内使用，若保存在2～8℃，可在24?h内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。

　　　　薄膜过滤法采用大样品量集菌的方法，具有代表性，不易漏检，仪器操作相对简单。

　　该系统是全封闭过滤系统，避免了操作过程中外源性微生物的污染，对试验结果的可信性影响较小。

　　因此无菌试验采用薄膜过滤法还是直接接种法并不依赖于验证结果，而是取决于样品的特性，如能采用过滤的方法均应采用薄膜过滤法检查。

　　　　若样品含有抑菌成分，当采用薄膜过滤法时，应先将供试液稀释后在过滤，这样可以减少滤膜对样品的吸附，减少冲洗量，进而减少微生物的损失或伤害。

　　　　无菌检查应作为稳定性考察的项目进行，以便对产品有效期的制定和合理的确定储存条件提供重要的依据。

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4.无形资产的评估方法

无菌检查法的抑细菌和抑真菌试验

在用直接接种法无菌检查前，可用如下方法测定供试品是否具有抑细菌和抑真菌作

　　用。用需气菌、厌气菌培养基4管及真菌培养基2管，分别接种金黄色葡萄球菌、生孢梭

菌、白色念珠菌均10～100个菌各两管，其中1管加供试品规定量，所有培养基管置规定

　　的温度，培养3～5天。如培养基各管24小时内微生物生长良好，则供试品无抑菌作用。

如加供试品的培养基管与未加供试品的培养基管对照比较，微生物生长微弱、缓慢或不

　　生长，均判为供试品有抑菌作用。该供试品需用稀释法（种入较大量培养基中）或中和

　　法、薄膜过滤法处理，消除供试品的抑菌性后，方可接种至培养基。

检查法

　　无菌检查法包括：直接接种法和薄膜过滤法。前者适用于非抗菌作用的供试品，后

　　者适用于有抗菌作用的或大容量的供试品。

操作时，应用适当的消毒液对供试品容器表面或外包装浸没或擦拭消毒后，以无菌

　　的方法取内容物。

　　凡无菌检查中，均应取相应溶剂和稀释剂同法操作，作阴性对照。

1.直接接种法

(1)供试品准备供试品如为注射液、供角膜穿通伤及手术用的滴眼剂或灭菌溶

　　液，按表1或表2规定量取供试品，混合。

供试品如为注射用无菌粉末或无菌冻干品或供直接分装成注射用的无菌粉末原料，

按表1或表2规定量取供试品，加入无菌水或0.9%无菌氯化钠溶液,或该药品项下规定的

　　溶剂用量制成一定浓度的供试品溶液。

供试品如为外科敷料，取供试品4个包装,以无菌操作拆开包装，于不同部位分别剪

　　取约100mg或1cm×3cm的供试品11份；肠线、缝合线取最小包装5个，拆开包装，共取11

　　股，接种于足以浸没供试品的适量培养基中。

供试品如为灭菌医用器具，依样品大小、形状的不同，取供试品11个，接种于足以

　　浸没供试品的适量培养基中。或用0.9%无菌氯化钠溶液各40ml，分别冲洗内壁（输血、

　　输液袋）收集各冲洗液，混合，按薄膜过滤法检查。

供试品如为青霉素类药品，按表1或表3规定量取供试品，分别加入足够使青霉素灭

　　活的无菌青霉素酶溶液适量，摇匀，混合。亦可按薄膜过滤法检查。

　　供试品如为放射性药品，取供试品1瓶（支），接种于装量为7.5ml的培养高卖基中。每

　　管接种量为0.2ml。

2.操作取上述备妥的供试品,以无菌操作将该供试品分别接种于需气菌、厌气菌

培养基6管，其中1管接种金黄色葡萄球菌对照用菌液1ml，作阳性对照,另接种于真菌培

　　养基5管。

　　轻轻摇动,使供试品与培养基混合。

　　需气菌、厌气菌培养基管置30～35℃、真。

　　菌培养基管置20～25℃培养7日。

　　在培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。

　　阳性对照。

管在24小时内应有菌生长，如在加入供试品后，培养基出现浑浊，培养7天后,不能从外

观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或斜面培养基上

继续培养，细菌培养2日，真菌培养3日，观察是否再出现浑浊或斜面有无菌生长，或用

　　接种环取培养液涂片，染色，用显微镜观察是否有菌。2.薄膜过滤法

如供试品有抗菌作用，按表1或表3规定量取供试品，按该药品项下规定的方法处理

后,加入0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜的溶剂至少100ml中,混合后，通过装有孔径

不大于0.45μm的薄膜过滤器，然后用0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜的溶液冲洗滤膜

　　至阳性对照菌正常生长。将需气菌、厌气菌培养基，真菌培养基用阳性对照管用培养基

分别加至薄膜过滤器内（封闭式过滤器），或取出滤膜分成3等份,分别加入上述二拿举种培

　　养基中，按规定温度和时间培养。阳戚敏逗性对照管应根据供试品特性加入相应对照菌液1ml(

　　抗细菌药物，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗厌氧菌药物，以生孢梭菌为对照菌；抗真

　　菌药物，以白色念珠菌为对照菌)。阳性对照管细菌应在培养24～48小时，真菌应在培养

　　24～72小时有菌生长。

结果判断

当阳性对照管显浑浊并确有细菌生长，阴性对照管呈阴性时，可根据观察所得的结

果判定：如需气菌、厌气菌及真菌培养基管均为澄清或虽显浑浊但经证明并非有菌生长,

　　均应判为供试品合格；如需气菌、厌气菌及真菌培养基管中任何1管显浑浊并确证为有

菌生长，应重新取2倍量供试品，分别依法复试，除阳性对照管外，其他各管均不得有

　　菌生长，否则应判为供试品不合格。

什么是无菌检查法?

无菌检查法

　　无菌检查法系指检查药品与敷料是否无菌的一种方法。

　　无菌检查的全部过程应严格遵守无菌操作，防止微生物的污染。

　　生物制品应按卫生部《生物制品制造及检定规程》中有关无菌检查的规定办理。

培养基及其制备方法

1.需气菌、厌气菌培养基(硫乙醇酸盐液体培养基)

酪胨（胰酶水解）

15g

氯化钠

2.5g

葡萄糖

新鲜配制的0.1％刃天青溶液

1.0ml

L－胱氨酸

0.5g

(或新鲜配制的0.2％亚甲蓝溶液0.5ml)

硫乙醇酸钠

0.5g

琼酯

0.5～0.7g

(或硫乙醇酸0.3ml)

水

1000ml

酵母浸出粉

　　除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分加入水内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，按量加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.1±0.2，分装，115℃灭菌30分钟。

　　在无菌检查接种前,培养基指示剂氧化层的颜色不得超过培养基深度约1/5。否则,须经水浴煮沸加热,只限加热一次。

2.霉菌培养基

胨

磷酸氢二钾（K2HPO4)

酵母浸出粉

硫酸镁（MgSO4·7H2O）

0.5g

葡萄糖

20g

蒸馏水

1000ml

　　除葡萄糖外，取上述成分加入水内，微温溶解后，调节pH约6.8，煮沸,加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，115℃灭菌20分钟。

3.选择性培养基

(1)对氨基苯甲酸培养基(用于磺胺类药物的无菌检查)

　　照上述需气菌、厌气菌培养基及霉菌培养基的处方及制法，各加对氨基苯甲酸0.125g，溶解后摇匀，分装，115℃灭菌30分钟。

(2)吐温培养基(用于油剂药品的无菌检查)

　　照上述需气菌、厌气菌培养基及霉菌培养基的处方及制法，各加10ml的吐温80，摇匀后，分装，115℃灭菌30分钟。

4.营养肉汤培养基伍铅老

胨

10g

肉浸液

1000ml

氯化钠

　　取胨与氯化钠，加入肉浸液内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，115℃灭菌30分钟。

5.营养琼脂培养基

　　照上述营养肉汤培养基的处方及制法，加入15～20g琼脂，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，115℃灭菌30分钟。

6.0.5％葡萄糖肉汤培养基

胨

10g

葡萄糖

氯化钠

肉浸液

1000ml

　　取胨与氯化钠加入肉浸液内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，115℃灭菌30分钟。

7.霉菌琼脂培养基

　　照霉菌培养基的处方及制法，加入15～20g琼脂，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，115℃灭菌20分钟，趁热斜放使凝固成激陪斜面。

　　上述培养基分别按15ml与40ml分装于试管中，装量约为试管高度的2/5，在115℃灭菌30分钟。细菌培养基经30～35℃培养48小腔升时，霉菌培养基经20～25℃培养72小时后，应无菌生长。

　　培养基的质量应通过灵敏度检查。

培养基灵敏度检查法

1.菌种

(1)藤黄微球菌(MicrococcusLutea)[CMCC(B)28001]

(2)生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)[CMCC(B)64941]

(3)白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]

2.操作

　　取藤黄微球菌的营养琼脂斜面和白色念珠菌的霉菌琼脂斜面的新鲜培养物分别用0.9％灭菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液;将生孢梭菌的不含琼脂需气菌、厌气菌培养基的新鲜培养物,吸入灭菌离心管，离心，弃去上清液，菌体用0.9％灭菌氯化钠溶液制成均匀菌悬液。分别取上述菌悬液用0.9％灭菌氯化钠溶液稀释至与细菌浊度标准管相同的浓度，然后，作10倍系列稀释并计数。

　　将藤黄微球菌1:10<5>～1:10<8>菌液、生孢梭菌1:10<6>～1:10<9>菌液、白色念珠菌1:10<5>～1:10<8>菌液各1ml,分别接种至9ml试验培养基中,每个稀释度至少接种3管,以未接种的培养基管作对照，细菌试验管置30～35℃培养3天,白色念珠菌试验管置20～25℃培养5天。逐日记录结果。

3.结果判定

　　以接种后培养基管数的2/3以上呈现生长的最高稀释度为该培养基的灵敏度（且接种菌量均应小于10个），三次试验中，以两次达到的最高灵敏度为判定标准。

　　需气菌、厌气菌培养基灵敏度为藤黄微球菌1:10<6>；生孢梭菌1:10<7>，霉菌培养基灵敏度为白色念珠菌1:10<6>。

[附注]

肉浸液制备法

　　取新鲜牛肉，除去肌腱及脂肪，切细，绞碎后,每1000g加水3000ml，充分拌匀，在2～10℃浸泡20～24小时，煮沸1小时，滤过，压干肉渣，补足液量，分装，121℃灭菌30分钟，置冷暗处备用。也可用牛肉浸出粉3g，加水1000ml,配成溶液代替。

对照用菌液

1.金黄色葡萄球菌（Staphylococcus

aureus）菌液

　　取金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]的营养琼脂斜面新鲜培养物1白金耳，接种至需气菌、厌气菌培养基内,在30～35℃培养16～18小时后，用0.9％灭菌氯化钠溶液稀释成1:10<6>。

2.生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）菌液

　　取生孢梭菌[CMCC(B)64941]的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物1白金耳,再接种至相同培养基内，在30～35℃培养18～24小时，用0.9％灭菌氯化钠溶液稀释至1:10<6>。

3.白色念珠菌（Candidaalbicans）菌液

　　取白色念珠菌[CMCC(F)98001]的霉菌琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳,接种至霉菌培养基内，在20～25℃培养24小时后，用0.9％灭菌氯化钠溶液稀释至1:10<5>。

检查法

1.直接接种法

　　(1)供试品如为注射液、供角膜创伤及手术用的滴眼剂或灭菌溶液,任取供试品2支（瓶）以上，用适当消毒液清洁供试品容器的外表面后,以无菌操作吸取规定接种量的供试品溶液，分别接种于需气菌、厌气菌培养基5管，其中1管接种对照用菌液1ml，供作阳性对照；取1支需气菌、厌气菌培养基管作阴性对照,另接种于霉菌培养基2管，供试品溶液的每管接种量与培养基的分装量，应根据供试品的装量,按下列规定取用：

供试品装量

每管接种量

培养基分装量

2ml或2ml以下

0.5ml

15ml

2ml以上至20ml

1.0ml

15ml

20ml以上

5.0ml

40ml

　　接种后轻轻摇动,使匀。

　　需气菌、厌气菌培养基在30～35℃培养5日,霉菌培养基在20～25℃培养7日，抗生素类药品均培养7日，放射性药品培养5～7日。

　　培养期间应逐日检查是否有菌生长（阳性对照在24小时内应有细菌生长）；如在加入供试品溶液后，培养基出现浑浊或沉淀，经培养后不能从外观上判断时,可取该培养液转种入另1支相同的培养基中或斜面培养基上，培养48～72小时后，观察是否再现浑浊或在斜面上有无菌落生长，并在转种的同时，取培养液少量，涂片制成染色标本，用显微镜观察是否有菌生长。

　　(2)供试品如为注射用灭菌粉末或无菌冻干品，照该药品项下的规定或按该药品剂量项下的溶剂用量，加入灭菌水或0.9％灭菌氯化钠溶液,使内容物溶解成均匀的供试品溶液，取规定接种量的供试品溶液，接种于上述培养基中。

　　(3)供试品如为供直接分装成注射用无菌粉末的原料药，按各该药品项下的规定制成溶液，依法接种于培养基中。

　　(4)供试品如为外科敷料，取供试品2个包装，以无菌操作拆开包装,于不同部位剪取约1cm×3cm的样品，分别接种于40ml培养基中。

　　(5)供试品如有抑菌作用或含有抑菌物质时，可选用适宜的培养基，或种入较大量的培养基中，使该供试品稀释至不具有抑菌使用的浓度；或照下述“薄膜过滤法”处理并接种于培养基中。

　　(6)供试品如为抗生素药品,取该品种正文中最大规格量的供试品不少于2瓶(支)。原料药按制剂规格项下,取最大规格量2份，分别加入足够使青霉素灭活的无菌青霉素酶溶液适量，摇匀，分别等量接种于每管装量为40ml的培养基中。

　　(7)供试品如为放射性药品，取供试品1瓶(支)，以每管接种量为0.2ml，接种于每管装量为7.5ml的培养基中。

2.薄膜过滤法

　　(1)供试品如为抗生素药品，取该品种正文中最大规格量的供试品不少于2瓶(支)。

　　原料药按制剂规格项下取最大规格量2份,分别按该药品项下规定的方法处理后,加入0.9％灭菌氯化钠溶液至少100ml或其他适宜的溶剂中,摇匀,以无菌操作加入装有直径约50mm、孔径不大于0.45±0.02μm微孔滤膜的薄膜过滤器内,减压抽干后,用0.9％灭菌氯化钠溶液或其他适宜的溶剂冲洗滤膜3次,每次至少100ml；取出滤膜,分成4片,取3片分别放在3管各40ml需气菌、厌气菌培养基中,其中1管接种对照用菌液1ml,供作阳性对照,另1片放在霉菌培养基管中。

　　取1支需气菌、厌气菌培养基管作阴性对照。

　　(2)供试品如为抗厌氧菌药品，取规定量的供试品，按上述方法经薄膜过滤器处理后，取出滤膜，分成4片，其中3片放在3管需气菌、厌气菌培养基管中，1管接种生孢梭菌对照用菌液1ml，供作阳性对照。

　　另1片放在霉菌培养基管中。

　　取1支需气菌、厌气菌培养基管作阴性对照。

　　(3)供试品如为抗真菌药品，取规定量的供试品,按上述方法经薄膜过滤器处理后,取出滤膜,分成4片，取2片分别放在2管需气菌、厌气菌培养基管中；2片分别放在2管霉菌培养基管中,其中1管接种白色念珠菌对照用菌液1ml，供作阳性对照。取1支需气菌、厌气菌培养基管作阴性对照。

结果判断

　　当阳性对照管显浑浊并确有细菌生长，阴性对照管阴性时,可根据观察所得的结果判定：如需气菌、厌气菌及霉菌培养管均为澄清或虽显浑浊但经证明并非有菌生长,均应判为供试品合格；如需气菌、厌气菌及霉菌培养管中任何1管显浑浊并确证为有菌生长，应重新取样，分别依法倍量复试，除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为供试品不合格。

无菌操作的原则是什么?

无菌技术的操作原则如下：

　　1、首先要在相并芦对无菌的环境中进行无菌操作。

　　2、操作者一定要带好口罩、帽子，穿好无菌衣，然后带好无菌手套，这时可以接触无菌物品，然后使举厅用无菌物品进行无菌操作，在无菌操作时千万不能触碰有菌物质，一旦触碰，则立即停止无菌操作，避免细菌感染的情况。所以无菌技术的基本操作原则是严格进行无菌操作，在操作的过程中不能触碰有菌物，否正蔽隐则操作失败。